децеллюляризация сердца что это
Децеллюляризованное сердце
На фото изображено сердце свиньи, прошедшее децеллюляризацию — очистку органа от всех клеток, в результате которой остается пустой «каркас» из внеклеточного матрикса, полностью сохраняющий свою структуру. В конце процесса очистки внеклеточный матрикс состоит в основном из фибриллярных белков, таких как коллаген и фибрин, а также из ламинина и протеогликанов. Этот метод — новое слово в регенеративной медицине и трансплантологии.
Важная проблема при трансплантации — поиск подходящего донора. Чтобы обойти эту проблему, ученые разрабатывают методы получения цельных органов в лаборатории, например 3D-печать или выращивание с помощью стволовых клеток. Благодаря методу децеллюляризации можно не создавать новый орган, а достаточно всего лишь очистить уже имеющийся. В основу этого метода лег тот факт, что при пересадке органа основную антигенную нагрузку несет его клеточный аппарат. При попадании антигенов донора в организм реципиента часто возникает ответная реакция иммунной системы и, как следствие, отторжение пересаженного органа. Таким образом, децеллюляризация позволяет получать неиммуногенные органы.
Работы по получению децеллюляризованного внеклеточного матрикса проводятся с 1970-х годов, однако исследования продвигались очень медленно, и только к концу XX века удалось провести децеллюляризацию таких простых органов, как кожа и мочевой пузырь, а также кровеносных сосудов и клапанов сердца. В 2008 году американские ученые смогли получить цельные «бесклеточные» сердца крыс, что стало прорывом в области тканевой инженерии и началом новой эпохи в области децеллюляризации органов. В настоящее время успешно проводят децеллюляризацию и других органов, например печени и почек.
Децеллюляризация сердца крысы (а–с). Ao — аорта, LA — левое предсердие, LV — левый желудочек, RA — правое предсердие, RV — правый желудочек. Видно, как сердце становится все более прозрачным по мере исчезновения клеток. d–f — окрашенные срезы левого желудочка на разных стадиях децеллюляризации, звездочками отмечены просветы кровеносных сосудов. Длина масштабного отрезка — 200 мкм. На срезах d, e видны ядра клеток и миофибриллы; на срезе f клеток уже нет. Изображение из статьи H. C. Ott et al., 2008. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart
Для создания бесклеточного матрикса нужно разрушить клеточные мембраны и нуклеиновые кислоты. Это происходит в несколько этапов и проводится разными методами или их комбинацией: физическими (термический или осмотический шок, механическое воздействие), химическими (использование различных детергентов), ферментативными (используются липазы, нуклеазы, трипсин и другие ферменты).
Хотя орган очищается от всех клеток, децеллюризованный матрикс содержит белки и факторы роста, необходимые для первичной адгезии, клеточной дифференцировки и пролиферации стволовых клеток реципиента. Чтобы трансплантировать орган, его надо заново рецеллюляризовать, для чего ученые заполняют каркас плюрипотентными стволовыми клетками, которые дифференцируются в клетки необходимого органа. В итоге получается полноценный орган, который можно пересадить без риска отторжения! Рецеллюляризация проводится в биореакторе, имитирующем физиологичные для органа условия. Получившийся орган содержит неповрежденную сосудистую сеть, с помощью которой можно заново «подключить» орган к кровоснабжению.
Этапы создания биоискусственного сердца с помощью перфузии, введения веществ через сосудистую сеть. А, Б — децеллюляризация, B, Г — рецеллюляризация: В — заполнение каркаса клетками эндотелия, они в организме выстилают внутреннюю поверхность кровеносных сосудов и полостей сердца, Г — заселение клетками сердца (неонатальными кардиомиоцитами), Д — функциональное сердце. Рисунок из статьи C. Gálvez-Montón et al., 2013. Cardiac tissue engineering and the bioartificial heart, с изменениями
К сожалению, эксперименты по трансплантации рецеллюляризованных органов пока находятся на этапе лабораторных исследований и проводятся только на животных, но учитывая, что наука в этой области движется семимильными шагами, будущее с применением децеллюляризованных матриксов не за горами.
Тканевая инженерия клапанов сердца: децеллюляризация
На долю операций по поводу заболеваний клапанного аппарата сердца приходится большая часть всех кардиохирургических вмешательств. Число пациентов, нуждающихся в протезировании клапанов сердца, на 2005 год составляло 290 тысяч человек.
С каждым годом качество, дизайн и свойства протезов становятся все совершеннее, но все равно не могут сравниться по своим свойствам с нативными клапанами. Самые частые осложнения после имплантации механических клапанов — это тромбоэмболии, кровотечения и протезный эндокардит. Биологические клапаны решают осложнения, возникающие с механическими клапанами, но им свойственна кальцификация и биодеградация, которые требуют реоперации через 10-15 дет. Для предотвращения возникновения вышеперечисленных осложнений и приближения к структуре естественных клапанов необходимо прибегнуть к тканевой инженерии.
Клапан состоит из специальных клеток и экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ), которые в ответ на механические воздействия могут ремоделироваться. Ежегодно клапан открывается и закрывается 40 млн раз в год и со временем претерпевает изменения в своей структуре. Клапан, изготовленный посредством тканей инженерии, должен быть прочным, гибким, адаптируемым к деформациям, атромбогенным, легко имплантируемым, а также иметь возможность расти вместе с пациентом.
Микроскопически створки клапана состоят из трех слоев: желудочкового, в составе которого эластиновые волокна, фиброзного, состоящего из коллагеновых волокон, и губчатого слоя, богатого гликозаминогликанами. Коллаген, эластин и гликозаминогликаны образуют ЭЦМ. Коллагеновые волокна не эластичны, имеют складчатую структуру и отвечают за противостояние нагрузкам во время диастолы. Эластиновые волокна восстанавливают сокращенную конфигурацию створок во время систолы. Губчатый же слой абсорбирует и гасит энергию удара струи крови во время систолы.
Клеточный состав включает эндотелиальные клетки (ЭК) и интерстициальные клетки (ИК. ЭК создают атромбогенную поверхность клапана и контролируют воспалительные и иммунные реакции. ИК — гетерогенная группа клеток, осуществляющих синтез компонентов ЭЦМ и его ремоделирование.
Первые попытки создания клапанов с помощью методов тканевой инженерии были предприняты M. Grimm et al. в 1991 году. Группа ученых исследовала рост ЭК на бычьем перикарде, фиксированном в глутаральдегиде.
Классическая технология тканей инженерии включает в себя создание каркасной основы, совмещение ее с клетками, инкубирование материала in-vitro для формирования прототипа ткани. Основными направлениями разработок каркасных основ являются: децеллюляризация тканей, создание синтетических рассасывающихся матриксов и полимеризованных биологических экстрацеллюлярных носителей, содержащих клетки.
Идеей метода децеллюляризации для изготовления клапанов является осознание того, что основную антигенную нагрузку несет клеточный аппарат клапана. Чаще всего имплантируемые ксенографты не соответствуют комплексам гистосовместимости. Кроме того, ксенографты фиксируются в глутаровом альдегиде, который, в свою очередь, является причиной цитотоксичных реакций, кальцификации и деградации.
Основной задачей децеллюляризации является устранение клеток при полном сохранении структуры ЭЦМ. Процесс создания бесклеточного матрикса складывается из этапа разрушения клеточных мембран и рибонуклеиновых кислот и этапа их экстракции при помощи разных детергентов. Чаще всего в качестве детергентов используются анионные, цвиттерионные, неионные вещества, энзимы (трипсин). Энзимы необходимы для расщепления и удаления ДНК и РНК.
Додецилсульфат натрия (SDS) до недавнего времени описывался как эффективный детергент по удалению клеток. Однако в последнее время большинство исследований доказывают дестабилизирующее действие SDS на матрикс: SDS дестабилизирует тройной спиральный домен коллагена и вызывает набухание эластина, разрушая тем самым ЭЦМ. После обработки клапанов SDS повышается их растяжимость, кроме того, после совмещения обработанных SDS створок клапана с ЭК происходит массивный лизис клеток спустя 24 часа после культивирования.
Использование гипо-и гипертонических растворов эффективно удаляет клеточные элементы, но при исследовании с антителами к главному комплексу гистосовместимости (MHC) определяется положительная реакция.
Множество исследований посвящены децеллюляризации трипсином. Практически во всех работах авторы сообщают о массивной деструкции коллагеновых и эластиновых компонентов ЭЦМ. Из-за этого определяется ранняя кальцификация, и снижается длительность «службы» клапана. Кроме того, трипсин негативно влияет на репопуляцию клапана клетками хозяина.
Деоксихолат натрия (SDC) — производное желчных кислот успешно применяется для децеллюляризации тканей с 2002 года.
Последнее десятилетие стало прорывом в области тканевой инженерии клапанов сердца. В 2000 году американская компания Cryolife начала выпускать децеллюляризированные свиные клапаны аорты под маркой «SynerGraft». Данные клапаны прошли успешные гидродинамические и иммунологические исследования и апробацию на овцах. Однако через несколько месяцев появились сообщения о плохом самочувствии детей, которым был имплантирован данный клапан. Через 2 года вышла статья с анализом ситуации. В ней сообщалось, что 1 пациент семи лет умер через 7 суток после операции, 1 девятилетний пациент умер спустя 6 месяцев после операции, еще 1 ребенок умер через год. Причиной смерти послужили клапан-ассоциированные осложнения в виде разрывов створок, воспалительных изменений и стенозов. 1 ребенку потребовалась реоперация спустя 2 суток после первичной операции. На всех клапанах наблюдались воспалительные изменения, фиброз, инкапсуляции, перфорации и износ створок. Причины до конца не ясны, но, вероятно, виной всему послужил далекий от оптимального протокол децеллюляризации.
В 2005 F.D. Da Costa с соавторами сообщили об 11 успешно выполненных операциях Росса с использованием децеллюляризированных аллографтов, изготовленных по оригинальной технологии Autotissue, при этом летальных случаев не отмечалось, 1 пациент был реоперирован по поводу кровотечения.
В целом, положительные результаты клинического применения децеллюляризированных ксено- и аллографтов вселяют надежду на дальнейшее развитие данного направления в тканевой инженерии и совершенствование протоколов децеллюляризации клапанов сердца.
С каждым годом качество, дизайн и свойства протезов становятся все совершеннее, но все равно не могут сравниться по своим свойствам с нативными клапанами. Самые частые осложнения после имплантации механических клапанов — это тромбоэмболии, кровотечения и протезный эндокардит. Биологические клапаны решают осложнения, возникающие с механическими клапанами, но им свойственна кальцификация и биодеградация, которые требуют реоперации через 10-15 дет. Для предотвращения возникновения вышеперечисленных осложнений и приближения к структуре естественных клапанов необходимо прибегнуть к тканевой инженерии.
Клапан состоит из специальных клеток и экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ), которые в ответ на механические воздействия могут ремоделироваться. Ежегодно клапан открывается и закрывается 40 млн раз в год и со временем претерпевает изменения в своей структуре. Клапан, изготовленный посредством тканей инженерии, должен быть прочным, гибким, адаптируемым к деформациям, атромбогенным, легко имплантируемым, а также иметь возможность расти вместе с пациентом.
Микроскопически створки клапана состоят из трех слоев: желудочкового, в составе которого эластиновые волокна, фиброзного, состоящего из коллагеновых волокон, и губчатого слоя, богатого гликозаминогликанами. Коллаген, эластин и гликозаминогликаны образуют ЭЦМ. Коллагеновые волокна не эластичны, имеют складчатую структуру и отвечают за противостояние нагрузкам во время диастолы. Эластиновые волокна восстанавливают сокращенную конфигурацию створок во время систолы. Губчатый же слой абсорбирует и гасит энергию удара струи крови во время систолы.
Клеточный состав включает эндотелиальные клетки (ЭК) и интерстициальные клетки (ИК. ЭК создают атромбогенную поверхность клапана и контролируют воспалительные и иммунные реакции. ИК — гетерогенная группа клеток, осуществляющих синтез компонентов ЭЦМ и его ремоделирование.
Первые попытки создания клапанов с помощью методов тканевой инженерии были предприняты M. Grimm et al. в 1991 году. Группа ученых исследовала рост ЭК на бычьем перикарде, фиксированном в глутаральдегиде.
Классическая технология тканей инженерии включает в себя создание каркасной основы, совмещение ее с клетками, инкубирование материала in-vitro для формирования прототипа ткани. Основными направлениями разработок каркасных основ являются: децеллюляризация тканей, создание синтетических рассасывающихся матриксов и полимеризованных биологических экстрацеллюлярных носителей, содержащих клетки.
Идеей метода децеллюляризации для изготовления клапанов является осознание того, что основную антигенную нагрузку несет клеточный аппарат клапана. Чаще всего имплантируемые ксенографты не соответствуют комплексам гистосовместимости. Кроме того, ксенографты фиксируются в глутаровом альдегиде, который, в свою очередь, является причиной цитотоксичных реакций, кальцификации и деградации.
Основной задачей децеллюляризации является устранение клеток при полном сохранении структуры ЭЦМ. Процесс создания бесклеточного матрикса складывается из этапа разрушения клеточных мембран и рибонуклеиновых кислот и этапа их экстракции при помощи разных детергентов. Чаще всего в качестве детергентов используются анионные, цвиттерионные, неионные вещества, энзимы (трипсин). Энзимы необходимы для расщепления и удаления ДНК и РНК.
Додецилсульфат натрия (SDS) до недавнего времени описывался как эффективный детергент по удалению клеток. Однако в последнее время большинство исследований доказывают дестабилизирующее действие SDS на матрикс: SDS дестабилизирует тройной спиральный домен коллагена и вызывает набухание эластина, разрушая тем самым ЭЦМ. После обработки клапанов SDS повышается их растяжимость, кроме того, после совмещения обработанных SDS створок клапана с ЭК происходит массивный лизис клеток спустя 24 часа после культивирования.
Использование гипо-и гипертонических растворов эффективно удаляет клеточные элементы, но при исследовании с антителами к главному комплексу гистосовместимости (MHC) определяется положительная реакция.
Множество исследований посвящены децеллюляризации трипсином. Практически во всех работах авторы сообщают о массивной деструкции коллагеновых и эластиновых компонентов ЭЦМ. Из-за этого определяется ранняя кальцификация, и снижается длительность «службы» клапана. Кроме того, трипсин негативно влияет на репопуляцию клапана клетками хозяина.
Деоксихолат натрия (SDC) — производное желчных кислот успешно применяется для децеллюляризации тканей с 2002 года.
Последнее десятилетие стало прорывом в области тканевой инженерии клапанов сердца. В 2000 году американская компания Cryolife начала выпускать децеллюляризированные свиные клапаны аорты под маркой «SynerGraft». Данные клапаны прошли успешные гидродинамические и иммунологические исследования и апробацию на овцах. Однако через несколько месяцев появились сообщения о плохом самочувствии детей, которым был имплантирован данный клапан. Через 2 года вышла статья с анализом ситуации. В ней сообщалось, что 1 пациент семи лет умер через 7 суток после операции, 1 девятилетний пациент умер спустя 6 месяцев после операции, еще 1 ребенок умер через год. Причиной смерти послужили клапан-ассоциированные осложнения в виде разрывов створок, воспалительных изменений и стенозов. 1 ребенку потребовалась реоперация спустя 2 суток после первичной операции. На всех клапанах наблюдались воспалительные изменения, фиброз, инкапсуляции, перфорации и износ створок. Причины до конца не ясны, но, вероятно, виной всему послужил далекий от оптимального протокол децеллюляризации.
В 2005 F.D. Da Costa с соавторами сообщили об 11 успешно выполненных операциях Росса с использованием децеллюляризированных аллографтов, изготовленных по оригинальной технологии Autotissue, при этом летальных случаев не отмечалось, 1 пациент был реоперирован по поводу кровотечения.
В целом, положительные результаты клинического применения децеллюляризированных ксено- и аллографтов вселяют надежду на дальнейшее развитие данного направления в тканевой инженерии и совершенствование протоколов децеллюляризации клапанов сердца.
Децеллюляризация сердца что это
Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН, Москва
ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия
ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия
ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия
Децеллюляризация органов и тканей
Журнал: Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 2019;(8): 59-62
Старцева О. И., Синельников М. Е., Бабаева Ю. В., Трущенкова В. В. Децеллюляризация органов и тканей. Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 2019;(8):59-62.
Startseva O I, Sinelnikov M E, Babayeva Yu V, Trushenkova V V. Decellularization of organs and tissues (in Russian only). Khirurgiya. 2019;(8):59-62.
https://doi.org/10.17116/hirurgia201908159
Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН, Москва
Использование аллогенных материалов в реконструктивной хирургии представляет научный интерес ввиду высокой доступности донорских тканей. Сложность аллотрансплантации заключена в гистологической несовместимости донорского материала и реципиентного организма. Результатом такой несовместимости является реакция гиперчувствительности на аллогенный трансплантат, которая в итоге приводит к отторжению пересаженных тканей и даже к летальному исходу. Клеточную биологическую несовместимость возможно исключить путем децеллюляризации органов и тканей, используемых для трансплантации. Усовершенствование методов децеллюляризации и реплантации клеток позволит массово применять аллогенный донорский материал в сложных реконструктивных манипуляциях, что значительно расширит возможности восстановительной хирургии.
Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН, Москва
ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия
ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия
ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия
Потребность в донорском материале для выполнения реконструктивных и пластических операций остается высокой. В развитии современной трансплантационной медицины можно проследить тенденцию к усовершенствованию методики пересадки органов и тканей с целью исключения отторжения трансплантата. Вопрос технического подхода к пересадке донорского материала раскрыт и тщательно разобран. Все хирургические аспекты технической части пересадки, такие как анастомозирование сосудов, лимфатическое дренирование, тканевое приживление, пересадка химерных лоскутов, — этапы, достаточно освоенные для выполнения качественной трансплантации. В настоящее время для пересадки аллогенного донорского материала актуален вопрос отторжения трансплантата.
Необходимость систематизации научных данных о современном состоянии аллогенной трансплантационной медицины связана с низким уровнем доступности данной информации.
Цель исследования — обзор исторических аспектов и современных данных о децеллюляризации органов и тканей. Систематический обзор литературных данных послужит базой для дальнейших научных исследований по данной тематике.
Материал и методы
Всего по теме децеллюляризации органов и тканей мы нашли около 30 источников. Для поиска использовали следующие ресурсы: PubMed, Medline, eMedicine, NLM (National Library of Medicine), ReleMed, Google Scholar. Наиболее актуальная информация, посвященная тканевой и клеточной дезагрегации, систематизирована в представленном обзоре литературы.
Реакция отторжения трансплантата бывает молниеносная, острая и хроническая (несколько месяцев и более после операции) [1]. Агрессивность иммунной реакции напрямую зависит от несовместимых геномных вариантов, кодирующих поверхностные белки главного комплекса гистосовместимости (MHC) классов I и II [2]. У человека эти белки называются человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA) [3]. Молниеносная и острые формы иммунного ответа могут быть легко устранены современными методами иммуносупрессии [4]. Иммунологические механизмы, ответственные за хроническое отторжение, изучены недостаточно. Лечение хронического отторжения трансплантата сводится к массивной иммуносупрессии, однако невозможно предотвратить пролиферацию специфического клона В-лимфоцитов, играющих роль в каскаде реакций выработки гуморального иммунитета к антигенам трансплантата [5]. Это приводит к необходимости поиска новых методик подготовки неиммуногенных тканей для трансплантации.
Результаты
Современный взгляд на аллогенную трансплантацию подразумевает подготовку пригодных бесклеточных, неиммуногенных тканей для пересадки на реципиентный организм. Бесклеточный тканевый матрикс можно получить методом ферментативной и химической обработки с целью удаления соматических клеток, обладающих сильной иммуногенностью. Для разделения компонентов цельной ткани и отделения внеклеточного матрикса (ВКМ) существуют методики дезагрегации. Выделяют механические методы тканевой дезагрегации, а также методы с использованием ферментативной биохимической дезагрегации. В результате образуется бесклеточная структура, каркасом которой служит ВКМ.
ВКМ является продуктом жизнедеятельности клеток и играет важную роль в жизнедеятельности самой ткани, принимает участие в коммуникации клеток, их делении и дифференцировке [6—8]. ВКМ служит тканевым каркасом для соматических клеток. Репаративные, каркасные и структурно-функциональные свойства ВКМ являются основополагающими в его эффективном применении в качестве основы для клеточной реплантации. Методы децеллюляризации должны предотвращать повреждение ВКМ, но при этом эффективно удалять клетки [9].
Методы децеллюляризации
Выбор метода децеллюляризации в целом зависит от целенаправленности лизиса определенных тканеспецифичных клеток. Важными критериями, предъявляемыми к агенту для децеллюляризации, являются способность эффективно удалять все клетки и клеточные компоненты из ткани, а также не вызывать изменений гистологической структуры ткани и химического состава ВКМ [10]. Ацеллюлярный бесклеточный матрикс может быть получен путем миграции клеток из тканевого фрагмента и дальнейшего их прикрепления к подходящему реципиентному субстрату. Дополнительно проводится дезагрегация ткани механическим путем или с использованием ферментативной обработки. Дезагрегация тканевых структур может быть как дополнением к методу клеточной миграции, так и альтернативным методом децеллюляризации. Основным способом обработки тканевых субстратов с целью децеллюляризации является их суспензионное ферментирование, а также перфузирование органов растворами детергентов [11].
Наиболее часто для дезагрегации ткани используются животные ферменты: трипсин неочищенный, коллагеназа, эластаза, проназа, диспаза, ДНКаза и гиалуронидаза. В зависимости от цели ферментативной обработки тканевого субстрата эти ферменты применяют отдельно либо в различных комбинациях. Например, ферментативную обработку эластазой в комбинации с ДНКазой проводят для выделения альвеолярных клеток II типа [12]. В практике наиболее часто используются ферментативные суспензии, содержащие комбинацию коллагеназы с диспазой или гуалуронидазой [13—15]. Для тканевого целлюлярного лизиса также используют растительные ферменты, такие как рекомбинантный кукурузный трипсин (Trypzean, «Sigma»), ферменты бактериальных культур Accutase и Accumax (продукты ICT — «Innovative Cell Technologies»). Ферменты не животного, синтетического и полусинтетического происхождения также подходят для первичной тканевой дезагрегации.
Целью ферментативной и химической децеллюляризации является получение бесклеточного тканевого каркаса, пригодного для дальнейшей имплантации клеточных клонов донорского организма. Бесклеточные каркасы, полученные различными способами децеллюляризации тканевого субстрата, в зависимости от применяемого метода имеют различные показатели эффективности децеллюляризации (чистота) и сохранности ацеллюлярного каркаса (прочность). Чистота и прочность полученного ацеллюлярного матрикса — важнейшие критерии оценки каркасных свойств продукта биохимической дезагрегации [16].
Особенности и сложности биохимической децеллюляризации можно проследить на аспектах биоинженерии сосудистой ткани, представленной Rieder, Macchiarini, Kobayashi и др. [17]. Ферментативный лизис тканевого субстрата с целью получения ацеллюлярного матрикса активно используют в биоинженерии аортальной ткани. Для химической децеллюляризации аорты используют детергенты — додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия, тертоктилфенилполиоксиэтилен (тритон Х-100), 3-[(3-холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфон. Для ферментативной децеллюляризации применяют трипсин, ДНКазу, РНКазу. Использование трипсина или неионного детергента тритона Х-100 с последующим перевариванием нуклеазой не элиминирует все клетки и тем самым создает риск иммунного ответа и кальцификации тканеинженерного сосуда при его трансплантации реципиенту. Продолжительная инкубация с трипсином эффективнее удаляет клетки, но нарушает структуру ВКМ. Применение додецилсульфата дестабилизирует тройной спиральный домен коллагена и эластиновую сеть, а при ненадлежащей отмывке делает рецеллюризацию малоэффективной. Использование тритона Х-100 и дезоксихолата натрия с последующим перфузированием средой М199 с добавлением нуклеаз для разрушения нуклеиновых кислот эффективно удаляет все клеточные компоненты аорты, не повреждая структуру каркаса. Эластин, ламинин, коллаген и другие сигнальные молекулы каркаса необходимы для дальнейшего приживления и дифференцировки сосудоспецифичных клеток. Полученный ацеллюлярный матрикс в дальнейшем был успешно рецеллюляризирован [18].
Современные аспекты
Децеллюляризация клапанных структур сердечно-сосудистой системы человека — это сложный процесс, который демонстрирует особенности комбинированной децеллюляризации аллогенных трансплантатов. Для дезагрегации человеческого клапана легочной артерии используют различные методики: обработку 1% раствором додецилсульфата натрия, 1% раствором дезоксихолата натрия, а также комбинацией этих растворов с редукцией концентрации до 0,5%. Для создания децеллюляризованных тканеинженерных протезов клапанов сердца используют SDS, SDC и комбинацию этих детергентов, эффективных агентов для децеллюляризации тканей сердечно-сосудистой системы [19, 20]. Наиболее эффективным методом для децеллюляризации является комбинированный подход, например сочетание двух ионных детергентов (0,5% SDS + 0,5% SDC) при децеллюляризации сердечных клапанов. Такая комбинация позволяет сохранить биомеханические свойства бесклеточного соединительнотканного клапанного каркаса без потери прочности и при высокой чистоте. Использование химической децеллюляризации детергентами подразумевает их дальнейшее удаление из аллотрансплантата. В сердечно-сосудистой биоинженерии оптимальным протоколом удаления детергентов является четырехкратная обработка аллографта в 200 мл фосфатного буферного раствора. При меньшем количестве буферных отмывок сохраняется недопустимая цитотоксичность, а при неоправданном увеличении (более 5 раз) снижается метаболическая активность мезенхимальных стволовых клеток и подавляются культуральные свойства, в частности способность адгезии к биоматериалу при реплантации [21].
Достижения в децеллюляризации тканей основаны на постулатах данного раздела биомедицины. Необходим раздельный подход к децеллюляризации различных тканей. Тканевые излишки, в том числе жировую ткань и некротизировнные ткани, удаляют механически во время забора ткани для трансплантации. Механическая обработка заключается в тонком разделении ткани острым инструментом. Используемые для тканевой дезагрегации ферменты необходимо удалять. Данную процедуру выполняют с помощью мягкого центрифугирования. При рецеллюляризации концентрация клеток в первичной культуре должна быть намного выше, чем обычно используемая при субкультивировании, так как процент клеток, которые выживут в первичной культуре, может быть довольно низким. Для выделения специфических типов клеток, требуются селективные среды. Следует отметить, что фетальная дезагрегация тканей проходит намного лучше, чем дезагрегация тканей взрослого человека. Скорость пролиферации фетальной дезагрегации выше.
Дермальные ацеллюлярные матриксы получают комбинированной дезагрегацией. Для изучения методов комбинированной дезагрегации рассмотрена процедура получения бесклеточного дермального матрикса, которая включает разрушение клеток дермы в гипертоническом растворе NaCl (альтернативно используется фермент диспаза). Экстрагирование продуктов дермальной клеточной дезагрегации и неколлагеновых экстрацеллюлярных белков проводят додецилсульфатом натрия или тритоном Х-100. В результате данной процедуры получают бесклеточный дермальный матрикс. Проводят его качественную стерилизацию [22]. Усовершенствованием данной методики является способ получения бесклеточного дермального матрикса следующим образом: дерму толщиной 0,2—0,3 мм помещают в 30% раствор карбамида с добавлением CaCl2 до концентрации 0,5%. Дерму в растворе карбамида выдерживают 24 ч при температуре 4 °C при соотношении обьема дермы к обьему карбамида 1:3. После этого дермальный матрикс помещают в 20% раствор карбамида. В таких уловиях матрикс выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре и периодическом встряхивании. Полученный таким образом ацеллюлярный кожный матрикс может быть сразу использован для пересадки. Как альтернатива возможна консервация матрикса. Этот метод децеллюляризации кожи исключает применение дополнительных способов стерилизации, не требует отмывания перед пересадкой, матрикс лучше фиксируется на ране благодаря усилению адгезивных свойств и сохраняет способность активизировать процессы регенерации в ране.
Применение в клинической практике тканеинженерных структур — необходимый этап регенеративной хирургии [23—25]. Использование аллогенных трансплантатов при реконструкции дыхательных путей позволит значительно улучшить исход реконструктивного вмешательства [26, 27].
Таким образом, использование ацеллюлярных бесклеточных матриксов позволяет хирургам избежать реакции отторжения трансплантата. Этот метод аллотрансплантации дает возможность выполнять пересадку свободных тканевых аллотрансплантатов без необходимости травматизации донорской зоны реципиента. Современные возможности данного метода позволяют печатать трехмерные макеты из децеллюляризованных тканевых структур [28, 29]. Совершенствование этой методики необходимо для достижения простых способов обработки аллогенных тканей в госпитальных лабораториях с целью разработки универсального атравматичного метода децеллюляризации, а также исключение серьезных последствий пересадки некачественно децеллюляризованного трансплантата [30].
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflict of interest.