для чего в биотехнологии используют метод культуры тканей
Метод культуры тканей: сущность и применение
Метод культуры тканей служит одним из главных инструментов современных биотехнологий, позволяя решать практические проблемы физиологии, биохимии и генетики растений. Искусственное выращивание материала проводится с соблюдением определенных условий: стерилизации, температурного режима и с выдержкой в специальной питательной среде.
Сущность
Метод культуры тканей представляет собой их длительное сохранение и/или искусственное выращивание в лабораторных условиях на питательной среде. Эта технология позволяет создать биологическую модель для изучения различных процессов в клетках, существующих вне организма растений, человека и животных.
Вам будет интересно: Изучение английского по «Скайпу»: отзывы о преподавателях и школах
В основе размножения культуры тканей растений лежит свойство тотипотентности – способности клеток развиваться до целого организма. У животных это реализуется только в оплодотворенных яйцеклетках (за исключением некоторых видов кишечнополостных).
История развития
Первые попытки культивирования растительных тканей предпринимались немецкими учеными на рубеже XIX-XX вв. Несмотря на то, что они оказались неудачными, был сформулирован ряд идей, которые подтвердились в дальнейшем.
В 1922 г. В. Роббинс и В.Котте, независимо друг от друга, смогли вырастить кончики корней кукурузы и томатов на искусственной питательной среде. Детальная проработка техники культуры клеток и тканей началась в 30-е гг. XX в. Р. Готре и Ф. Уайт доказали, что при периодической пересадке тканевых культур в свежую питательную среду они могут расти неограниченно долго.
К 1959 г. в лабораторных условиях выращивалось уже 142 вида растений. Во второй половине XX в. началось также использование диспергированных (разобщенных) клеток.
Типы исследуемого материала
Различают 2 основных вида культур тканей растений:
По способу выращивания выделяют следующие методы:
Культивирование из отдельных клеток сопряжено с определенными трудностями. Для того чтобы искусственно «заставить» их делиться, они должны получать сигнал от соседних, активно функционирующих клеток.
Одним из основных видов тканей для физиологических исследований служат каллусные, возникающие при неблагоприятных внешних факторах (обычно при механическом травмировании). Они обладают способностью к утрате специфических характеристик, присущих исходной ткани. В результате клетки каллуса начинают активно делиться и образуются части растения.
Необходимые условия
Успешность метода культуры тканей и клеток зависит от следующих факторов:
В качестве питательных сред в настоящее время применяют готовые коммерческие составы (Мурасиге и Скуга, Гамборга и Эвелега, Уайта, Као и Михайлюка и другие).
Достоинства и недостатки
Преимуществами метода культуры клеток и тканей являются:
К недостатком данной биотехнологии относят:
Применение
Метод культуры тканей используется для проведения исследований:
Перспективными направлениями биологии и фармакологии, при развитии которых используется данная технология, являются:
Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений
Биотехнология как наука базируется на использовании биологических процессов в технике и промышленном производстве.
Вся сфера научной деятельности по реорганизации геномов обычно называется биотехнологией, хотя этот термин включает в себя более широкий круг понятий, чем культура изолированных тканей, генная и хромосомная инженерия.
Роль биотехнологии и, в частности, культуры изолированных тканей, состоит в решении таких глобальных проблем, как обеспечение населения продовольствием, более эффективная медицина, оптимальная экология.
Несомненно, что в настоящее время наиболее перспективными обсуждаемыми и иногда осуждаемыми направлениями биотехнологии являются генная и хромосомная инженерии, но вытекали они из культивирования изолированных органов, тканей и клеток и немыслимы без него.
Тотипотентность растительной клетки
Методы культивирования изолированных фрагментов растений основаны на использовании важного свойства растительной клетки — тотипотентности.
Тотипотентностью обладают оплодотворенные яйцеклетка растений и яйцо животных организмов. Что касается дифференцированных клеток, то у животных тотипотентность присуща только некоторым клеткам кишечнополостных. Так, соматические клетки гидры дают начало новому организму.
У высших животных с ранних этапов эмбриогенеза, с началом специализации клеток, тотипотентность не реализуется.
Образование каллуса можно наблюдать при прививках в местах срастания привоя и подвоя. Каллус способствует заживлению ран и первоначально состоит из недифференцированных клеток, начало которым на раневой поверхности дают клетки тканей, способные к дедифференциации (камбий, флоэма, молодые клетки ксилемы). Впоследствии в каллусе может иметь место вторичная дифференциация с образованием специализированных тканей и органов.
Однако в природных условиях растения ряда систематических групп тотипотентность не проявляют. Ввиду высокой специализации клеток многие однодольные растения утратили способность к раневой реакции и вегетативному размножению.
Возможность реализации супрессированной in vivo и активной тотипотентности предоставляется в условиях in vitro при выращивании фрагментов тканей, органов или клеток на искусственных питательных средах. Этот переход специализированных клеток к эмбриональным синтезам, последующему делению с образованием недифференцированных клеток, а затем и к повторной дифференциации осуществляется под действием экзогенных фитогормонов.
Исторические этапы развития методов культивирования in vitro
Образование каллуса впервые описано французским энциклопедистом Дугамелем (1756), опубликовавшим результаты по изучению циркуляции клеточного сока и заживлению ран у растений, срастанию тканей при прививках.
Позже выполненный микроскопический анализ срезов каллуса, индуцированного на стеблях декоративных древесных растений, позволил Трекулу (1853) выявить, что образование каллуса может происходить от разных тканей (камбиальной, флоэмы и очень молодых частей ксилемы).
При культивировании фрагментов из почек тополя и ясеня, из корней свеклы и турнепса на поверхности сырого песка он показал, что с уменьшением толщины экспланта до 1,5 мм (не более чем 21-клеточный слой) способность к регенерации перестает проявляться.
Термин «тотипотентность» как способность растительных клеток к регенерации был введен Гебелем (1902), подтвердившим своими экспериментами результаты Фёхтинга.
Описанные эксперименты относят к культивированию изолированных тканей. И первой поддерживающей основой твердой среды был песок, а в качестве питательного компонента использовали воду. Однако для успешного воспроизводства методов культивирования in vitro необходимо использование многокомпонентных искусственных питательных сред и соблюдение асептических условий.
Впервые такой подход был применен Габерландтом (1902). В качестве питательной среды им был взят раствор минеральных солей по Кнопу, используемый с 1865 г. для песчаных культур, с добавлением источника углеводов сахарозы.
Вместе с тем для своих экспериментов Габерландт в качестве эксплантов использовал только высокоспециализированные клетки (тычиночные волоски традесканции, железистые волоски медуницы и крапивы, клетки сердцевины черешков водного гиацинта, замыкающие клетки устьиц лилейных, палисадные клетки из листьев яснотки).
В условиях культивирования такие клетки оставались живыми в течение месяца, увеличивали размер, изменяли форму, накапливали крахмал, но их деления не происходило. Это было связано не только с высокой специализацией клеток, но и с отсутствием в питательной среде веществ, способных индуцировать клеточное деление. Габерландт писал, что у изолированных для культивирования тканей отсутствуют стимулы, исходящие от целого организма или его частей.
Следует отметить, что в начале века успехов добились зоологи, работавшие в области культивирования тканей животных. Благодаря работам Гаррисона (1907), Карреля (1911) и других исследователей была создана методика выращивания тканей животных на питательных средах природного происхождения (плазме крови, зародышевой жидкости).
На фоне временных неудач по культивированию изолированных тканей и клеток растений с начала века получил развитие метод культуры изолированных зародышей, широко используемый в настоящее время для решения многих задач биологии и биотехнологии. В 1904 г. Ханниг провел успешную серию экспериментов по культивированию уже в асептических условиях практически зрелых изолированных зародышей крестоцветных на растворе минеральных солей и сахарозы. Однако зародыши, изолированные из незрелых семян, в этих условиях не дифференцировались.
Практическое применение культуры изолированных зародышей для преодоления несовместимости при отдаленной гибридизации было продемонстрировано работами Лайбаха (1925). Он вычленял зародыши из нежизнеспособных гибридных семян льна, завязавшихся в результате скрещивания двух видов Linum perenne x Linum austriacum, и культивировал их на фильтровальной бумаге или вате, смоченных раствором сахарозы. В результате были выращены гибридные растения.
В Германии Котти (1922) и в США Роббинс (1922) постулировали необходимость использования для культивирования меристематических клеток, изолированных из кончиков корней или почек, более сложных по составу культуральных сред с добавлением аминокислот и дрожжевого экстракта.
Эти подходы были удачно реализованы в 30-е гг. в работах американского исследователя Филиппа Уайта и французского исследователя Роже Готре, которых принято считать родоначальниками современных методов культивирования изолированных органов и тканей растений. Успех работ Уайта и Готре был определен оптимальным сочетанием объектов культивирования и состава питательных сред.
Серия работ Уайта (1934) была посвящена выращиванию изолированных корней томатов, которые при периодических пересадках (пассировании) отрезками кончиков корней на свежую среду могли расти неограниченно долго.
Другое направление работ Уайта связано с изучением опухолей растений, для чего был использован метод культивирования изолированных тканей.
Большое значение имеют работы Уайта (1939; 1941), посвященные разработке составов питательных сред. Среда Уайта, содержащая наряду со смесью минеральных солей и витамины, в настоящее время широко используется для выращивания тканей многих культур. При культивировании ткани табака на этой среде впервые удалось наблюдать спонтанное развитие зачатков стеблевых почек и формирование побегов.
После появления работ Р. Готре и Ф. Уайта метод культуры изолированных тканей растений начал быстро развиваться во многих странах. Вводили в культуру все новые и новые виды растений.
В 1957 г. впервые индуцирован морфогенез в культуре каллусной ткани моркови и получены растения-регенераты. Успех достигнут благодаря работам Бутенко и Стеварда. Огромная заслуга в развитии биотехнологических работ в нашей стране принадлежит Р.Г. Бутенко из Института физиологии растений РАН. Вместе со своими сотрудниками она создала мощную школу по культуральным работам у растений, что значительно расширило возможности по реконструкции, именно генома растений.
В 1959 г. Никел и Тулик создали метод выделения и выращивания больших масс клеточных суспензий, а вслед за этим Джонсон (1 960), Павловай и Бутенко (1969) разработали метод культивирования отдельной клетки с помощью ткани-няньки.
В 1959 г. французский ученый Ж. Морель предложил метод культивирования изолированных меристем, который он использовал для микроразмножения орхидей. Еще ранее этим же методом он получил безвирусные растения картофеля. В нашей стране работы по микроразмножению меристемным методом на гербере были выполнены в Институте физиологии АН СССР под руководством Р.Г. Бутенко (1960, 1964).
В 1960 г. английским профессором Коккингом были впервые получены с использованием ферментов изолированные протопласты и разработаны условия для их культивирования. Через 10 лет, в 1970 г., в той же лаборатории Пауэр с сотрудниками осуществили искусственное слияние протопластов и таким образом открыли путь к созданию соматических гибридов.
В 1964 г. индийские ученые Гуха и Магешвари индуцировали андрогенез в культуре пыльников и использовали этот метод для получения гаплоидных растений.
В 1971 г. Загорска и другими впервые получены, изучены и описаны сомаклональные варианты табака.
Таким образом, открытие самой возможности роста клеток вне организма и регенерации из них растений, а также веществ, стимулирующих этот процесс (фитогормонов), создало предпосылки для повышения эффективности растениеводства и селекции растений, а также новых возможностей использования растений (промышленное производство БАВ, съедобные вакцины и др.).
Наибольшее распространение в практике в настоящее время имеют результаты исследований по тканевой и клеточной биотехнологии. Клетки и ткани растений, выращиваемые на искусственных питательных средах в стерильных условиях (в стекле), называют культурой изолированных тканей.
Значение и место культуры тканей в биотехнологии растений
Биотехнология как наука базируется на использовании биологических процессов в технике и промышленном производстве.
Вся сфера научной деятельности по реорганизации геномов обычно называется биотехнологией, хотя этот термин включает в себя более широкий круг понятий, чем культура изолированных тканей, генная и хромосомная инженерия.
Роль биотехнологии и, в частности, культуры изолированных тканей, состоит в решении таких глобальных проблем, как обеспечение населения продовольствием, более эффективная медицина, оптимальная экология.
Несомненно, что в настоящее время наиболее перспективными обсуждаемыми и иногда осуждаемыми направлениями биотехнологии являются генная и хромосомная инженерии, но вытекали они из культивирования изолированных органов, тканей и клеток и немыслимы без него.
Тотипотентность растительной клетки
Методы культивирования изолированных фрагментов растений основаны на использовании важного свойства растительной клетки — тотипотентности.
Тотипотентностью обладают оплодотворенные яйцеклетка растений и яйцо животных организмов. Что касается дифференцированных клеток, то у животных тотипотентность присуща только некоторым клеткам кишечнополостных. Так, соматические клетки гидры дают начало новому организму.
У высших животных с ранних этапов эмбриогенеза, с началом специализации клеток, тотипотентность не реализуется.
Образование каллуса можно наблюдать при прививках в местах срастания привоя и подвоя. Каллус способствует заживлению ран и первоначально состоит из недифференцированных клеток, начало которым на раневой поверхности дают клетки тканей, способные к дедифференциации (камбий, флоэма, молодые клетки ксилемы). Впоследствии в каллусе может иметь место вторичная дифференциация с образованием специализированных тканей и органов.
Однако в природных условиях растения ряда систематических групп тотипотентность не проявляют. Ввиду высокой специализации клеток многие однодольные растения утратили способность к раневой реакции и вегетативному размножению.
Возможность реализации супрессированной in vivo и активной тотипотентности предоставляется в условиях in vitro при выращивании фрагментов тканей, органов или клеток на искусственных питательных средах. Этот переход специализированных клеток к эмбриональным синтезам, последующему делению с образованием недифференцированных клеток, а затем и к повторной дифференциации осуществляется под действием экзогенных фитогормонов.
Исторические этапы развития методов культивирования in vitro
Образование каллуса впервые описано французским энциклопедистом Дугамелем (1756), опубликовавшим результаты по изучению циркуляции клеточного сока и заживлению ран у растений, срастанию тканей при прививках.
Позже выполненный микроскопический анализ срезов каллуса, индуцированного на стеблях декоративных древесных растений, позволил Трекулу (1853) выявить, что образование каллуса может происходить от разных тканей (камбиальной, флоэмы и очень молодых частей ксилемы).
При культивировании фрагментов из почек тополя и ясеня, из корней свеклы и турнепса на поверхности сырого песка он показал, что с уменьшением толщины экспланта до 1,5 мм (не более чем 21-клеточный слой) способность к регенерации перестает проявляться.
Термин «тотипотентность» как способность растительных клеток к регенерации был введен Гебелем (1902), подтвердившим своими экспериментами результаты Фёхтинга.
Описанные эксперименты относят к культивированию изолированных тканей. И первой поддерживающей основой твердой среды был песок, а в качестве питательного компонента использовали воду. Однако для успешного воспроизводства методов культивирования in vitro необходимо использование многокомпонентных искусственных питательных сред и соблюдение асептических условий.
Впервые такой подход был применен Габерландтом (1902). В качестве питательной среды им был взят раствор минеральных солей по Кнопу, используемый с 1865 г. для песчаных культур, с добавлением источника углеводов сахарозы.
Вместе с тем для своих экспериментов Габерландт в качестве эксплантов использовал только высокоспециализированные клетки (тычиночные волоски традесканции, железистые волоски медуницы и крапивы, клетки сердцевины черешков водного гиацинта, замыкающие клетки устьиц лилейных, палисадные клетки из листьев яснотки).
В условиях культивирования такие клетки оставались живыми в течение месяца, увеличивали размер, изменяли форму, накапливали крахмал, но их деления не происходило. Это было связано не только с высокой специализацией клеток, но и с отсутствием в питательной среде веществ, способных индуцировать клеточное деление. Габерландт писал, что у изолированных для культивирования тканей отсутствуют стимулы, исходящие от целого организма или его частей.
Следует отметить, что в начале века успехов добились зоологи, работавшие в области культивирования тканей животных. Благодаря работам Гаррисона (1907), Карреля (1911) и других исследователей была создана методика выращивания тканей животных на питательных средах природного происхождения (плазме крови, зародышевой жидкости).
На фоне временных неудач по культивированию изолированных тканей и клеток растений с начала века получил развитие метод культуры изолированных зародышей, широко используемый в настоящее время для решения многих задач биологии и биотехнологии. В 1904 г. Ханниг провел успешную серию экспериментов по культивированию уже в асептических условиях практически зрелых изолированных зародышей крестоцветных на растворе минеральных солей и сахарозы. Однако зародыши, изолированные из незрелых семян, в этих условиях не дифференцировались.
Практическое применение культуры изолированных зародышей для преодоления несовместимости при отдаленной гибридизации было продемонстрировано работами Лайбаха (1925). Он вычленял зародыши из нежизнеспособных гибридных семян льна, завязавшихся в результате скрещивания двух видов Linum perenne x Linum austriacum, и культивировал их на фильтровальной бумаге или вате, смоченных раствором сахарозы. В результате были выращены гибридные растения.
В Германии Котти (1922) и в США Роббинс (1922) постулировали необходимость использования для культивирования меристематических клеток, изолированных из кончиков корней или почек, более сложных по составу культуральных сред с добавлением аминокислот и дрожжевого экстракта.
Эти подходы были удачно реализованы в 30-е гг. в работах американского исследователя Филиппа Уайта и французского исследователя Роже Готре, которых принято считать родоначальниками современных методов культивирования изолированных органов и тканей растений. Успех работ Уайта и Готре был определен оптимальным сочетанием объектов культивирования и состава питательных сред.
Серия работ Уайта (1934) была посвящена выращиванию изолированных корней томатов, которые при периодических пересадках (пассировании) отрезками кончиков корней на свежую среду могли расти неограниченно долго.
Другое направление работ Уайта связано с изучением опухолей растений, для чего был использован метод культивирования изолированных тканей.
Большое значение имеют работы Уайта (1939; 1941), посвященные разработке составов питательных сред. Среда Уайта, содержащая наряду со смесью минеральных солей и витамины, в настоящее время широко используется для выращивания тканей многих культур. При культивировании ткани табака на этой среде впервые удалось наблюдать спонтанное развитие зачатков стеблевых почек и формирование побегов.
После появления работ Р. Готре и Ф. Уайта метод культуры изолированных тканей растений начал быстро развиваться во многих странах. Вводили в культуру все новые и новые виды растений.
В 1957 г. впервые индуцирован морфогенез в культуре каллусной ткани моркови и получены растения-регенераты. Успех достигнут благодаря работам Бутенко и Стеварда. Огромная заслуга в развитии биотехнологических работ в нашей стране принадлежит Р.Г. Бутенко из Института физиологии растений РАН. Вместе со своими сотрудниками она создала мощную школу по культуральным работам у растений, что значительно расширило возможности по реконструкции, именно генома растений.
В 1959 г. Никел и Тулик создали метод выделения и выращивания больших масс клеточных суспензий, а вслед за этим Джонсон (1 960), Павловай и Бутенко (1969) разработали метод культивирования отдельной клетки с помощью ткани-няньки.
В 1959 г. французский ученый Ж. Морель предложил метод культивирования изолированных меристем, который он использовал для микроразмножения орхидей. Еще ранее этим же методом он получил безвирусные растения картофеля. В нашей стране работы по микроразмножению меристемным методом на гербере были выполнены в Институте физиологии АН СССР под руководством Р.Г. Бутенко (1960, 1964).
В 1960 г. английским профессором Коккингом были впервые получены с использованием ферментов изолированные протопласты и разработаны условия для их культивирования. Через 10 лет, в 1970 г., в той же лаборатории Пауэр с сотрудниками осуществили искусственное слияние протопластов и таким образом открыли путь к созданию соматических гибридов.
В 1964 г. индийские ученые Гуха и Магешвари индуцировали андрогенез в культуре пыльников и использовали этот метод для получения гаплоидных растений.
В 1971 г. Загорска и другими впервые получены, изучены и описаны сомаклональные варианты табака.
Таким образом, открытие самой возможности роста клеток вне организма и регенерации из них растений, а также веществ, стимулирующих этот процесс (фитогормонов), создало предпосылки для повышения эффективности растениеводства и селекции растений, а также новых возможностей использования растений (промышленное производство БАВ, съедобные вакцины и др.).
Наибольшее распространение в практике в настоящее время имеют результаты исследований по тканевой и клеточной биотехнологии. Клетки и ткани растений, выращиваемые на искусственных питательных средах в стерильных условиях (в стекле), называют культурой изолированных тканей.
КУЛЬТУ́РА КЛЕ́ТОК И ТКА́НЕЙ
Том 16. Москва, 2010, стр. 311
Скопировать библиографическую ссылку:
КУЛЬТУ́РА КЛЕ́ТОК И ТКА́НЕЙ, клетки, кусочки тканей или зачатков органов, выращенные вне организма (in vitro). В основе выращивания клеток и тканей лежит строгое соблюдение стерильности и использование спец. питат. сред, обеспечивающих поддержание жизнедеятельности культивируемых клеток и максимально сходных со средой, с которой клетки взаимодействуют в организме. Метод получения К. к. и т. является одним из важнейших в эксперим. биологии. К. к. и т. могут быть заморожены и сохраняться длительное время при темп-ре жидкого азота (–196 °C). Основополагающий эксперимент по культивированию клеток животных провёл амер. учёный Р. Гаррисон в 1907, поместив кусочек зачатка нервной системы зародыша лягушки в сгусток лимфы. Клетки зачатка оставались живыми неск. недель, из них вырастали нервные волокна. Со временем метод был усовершенствован А. Каррелем (Франция), М. Берроузом (США), А. А. Максимовым (Россия) и др. учёными, использовавшими в качестве питат. среды плазму крови и вытяжку из тканей зародыша. В дальнейшем успехи в получении К. к. и т. были связаны с разработкой сред определённого химич. состава для культивирования разл. типов клеток. Обычно они содержат соли, аминокислоты, витамины, глюкозу, факторы роста, антибиотики, предупреждающие заражение культуры бактериями и микроскопич. грибами. Начало созданию метода К. к. и т. у растений (на кусочке флоэмы моркови) положено Ф. Стюардом (США) в 1958.