для чего строятся калибровочные графики
Построение калибровочного графика
Для построения калибровочного графика готовят серию стандартных растворов, охватывающих диапазон измеряемых концентраций исследуемого вещества согласно методике.
Калибровочный график строят по 5-6 сериям шкал; количество концентраций в каждой шкале должно быть не мене 5. Резко отличающиеся значения оптической плотности не учитывают. Из остальных рассчитывают среднее арифметическое значение для каждой концентрации и строят график зависимости оптической плотности от концентрации вещества (рисунок 14).
Примерный размер графика 20-25×30 см; прямая должна проходить через начало координат под углом приблизительно 45°. В идеальном случае все точки располагаются на прямой, обычно часть точек располагается на прямой, часть выше и ниже ее, точки как бы чередуются.
На графике должны быть указаны условия фотометрирования: номер светофильтра или длины волны (нм); размер кюветы (мм); время фотометрирования. Кроме того, должна быть указана дата построения калибровочного графика. Калибровочный график необходимо периодически проверять по 2-3 концентрациям.
Наиболее распространенными приборами являются фотоэлектроколориметр ФЭК-56М, колориметр фотоэлектрический однолучевой КФО, колориметр фотоэлектрический концентрационный КФК-2 (рисунок 15), КФК-2МП с микропроцессорной системой «Электроника» и спектрофотометр СФ-46 (таблица 2).
| Марка прибора | Спектральный диапазон, нм | Число светофильтров |
| ФЭК-56М | 315-630 | |
| КФО | 400-700 | |
| КФК-2 (КФК-2МП) | 315-980 | И |
| СФ-46 | 190-1100 | — |
Надежность результатов измерений при работе на фотоэлектроколориметрах и спектрофотометрах обеспечивается, правильной установкой и эксплуатацией приборов. Поэтому приступать к измерениям можно только после тщательного ознакомления с описанием устройства прибора и правил его эксплуатации.
Методика работы на колориметре фотоэлектрическом концентрационном КФК-2:
Подготовка к работе. Прибор включают в сеть за 15 мин до начала измерений. Во время прогрева кюветное отделение должно быть открыто (при этом шторка перед фотоприемниками перекрывает световой пучок). Затем устанавливают необходимый цветной светофильтр и устанавливают ручку «чувствительность» в положение «1» (при измерении со светофильтрами 315, 364, 400, 440, 490, 540 нм, обозначенными на лицевой панели прибора цифрами черного цвета, ручку «чувствительность» устанавливают в положение «1», «2», «3», обозначенных на лицевой панели также цифрами черного цвета). При измерении со светофильтрами 590, 670, 750, 870, 980 нм, обозначенными на лицевой панели прибора цифрами красного цвета, ручку «чувствительность» устанавливают в одно из положений «1», «2», «3», обозначенных на лицевой стороне панели также цифрами красного цвета. Ручку «установка 100 грубо» переводят в крайнее левое положение. Перед измерениями и при переключении фотоприемников необходимо проверить установку стрелки прибора на «О» по шкале коэффициентов пропускания «Т» при открытом кюветном отделении. При перемещении стрелки от нулевого положения ее подводят к нулю с помощью потенциометра «нуль», выведенного под шлиц.
Определение оптической плотности. В кюветное отделение устанавливают кюветы с растворителем (или контрольным раствором) и исследуемыми растворами. Сначала световой пучок пропускают через кювету с растворителем (или контрольным раствором). Закрывают крышку кюветного отделения. Ручками «чувствительность» и «установка 100 грубо» и «точно» устанавливают отсчет 100 по шкале прибора. Затем поворотом ручки заменяют кювету с растворителем (или контрольным раствором) на кювету с исследуемым раствором. Снимают показания по шкале прибора в единицах оптической плотности. Измерение проводят 3-5 раз, и окончательное значение оптической плотности определяют как среднее арифметическое.
ОСНОВЫ МЕТОДА КАЛИБРОВОЧНОГО ГРАФИКА
Калибровочные графики используются только в физических и физико-химических методах анализа. На фоне победных реляций физиков-теоретиков об успешном описании физических и физико-химических процессов возникает вопрос: если все так хорошо изучено, то зачем вообще нужны калибровочные графики? Они нужны для того, чтобы учесть все факторы, влияющие на процесс анализа, которые теоретически учесть довольно трудно. К факторам такого рода можно отнести сложную кинетику химической реакции, аномальные константы равновесия, коэффициенты активности т.п. Из этого следует, что легче построить калибровочный график, чем заниматься утомительными поправками к теоретическим прогнозам.
Принцип построения калибровочного графика несложен. Готовятся несколько стандартных растворов (5-6 растворов, реже меньше 4) с известным содержанием определяемого вещества. В каждом стандартном растворе измеряется аналитический сигнал прибором, который используется в данном виде анализа. По результатам измерений строится график в координатах аналитический сигнал – содержание вещества в стандартном растворе. Построенный график является калибровочным. Далее все становится еще проще: проводятся измерения в анализируемом растворе, в котором следует узнать концентрацию определяемого вещества. Получив величину аналитического сигнала, с помощью калибровочного графика, находится концентрация, которая соответствует этому сигналу. На этом процедура анализа считается завершенной.
Простота простотой, но надо разъяснить некоторые технические детали построения калибровочного графика. Когда говорят о калибровочном графике, то всегда (за малым исключением) подразумевают прямую линию. Прямая линия является либо естественной функцией аналитического сигнала от концентрации, либо экспериментальные данные подвергаются линеаризации, чтобы в итоге калибровка стала прямой. Отсюда возникает вопрос: а почему калибровка должна быть представлена в виде прямой? В наше время, когда компьютер стоит на каждом столе, не слишком ли примитивно строить прямые? Тут дело обстоит не столько в математической обработке результатов, сколько в потребности лишний раз убедиться в том, что калибровочная прямая подтверждает ожидаемый физико-химический закон. Оценку этого легче проводить по параметрам прямой, чем по виду кривой линии. Таким образом, если при построении калибровочной прямой мы лишний раз убеждаемся, что это действительно прямая, то со спокойной совестью мы можем констатировать ожидаемое течение реакции и нормальное функционирование прибора.
Приведем пример построения калибровки для спектрофотометрического метода анализа.
Оптическая плотность окрашенных растворов находится в линейной зависимости от концентрации окрашенного вещества в растворе. Об этом свидетельствует закон Бугера-Ламберта-Бера:
ε – молярный коэффициент погашения;
C – молярная концентрация раствора, моль/л;
l – толщина кюветы, см.
Отсюда вывод о виде калибровочного графика отсюда однозначен: график должен быть прямой линией и исходить из нуля.
Действительность же приносит сюрпризы. Во-первых, калибровки часто не исходят из нуля. Во-вторых, калибровочный график имеет концентрационные пределы линейности. Со второй особенностью разбираться можно долго и безрезультатно, поэтому примем этот факт и смиримся с ним, используя только линейную область калибровки. С первым сюрпризом дело обстоит несколько проще. Причин, которые мешают исходить калибровочной прямой из нуля обычно две. Первая причина несерьезна и легко устранима. Она состоит в том, что кюветы имеют чуть разные размеры или дефекты стекла. Разность эта невелика и может достигать 0,001-0,002 единиц оптической плотности. Измерить эту разность несложно, достаточно залить в кюветы фоновый раствор, не содержащий анализируемого вещества, и измерить оптическую плотность растворов друг относительно друга.
Если же калибровочная прямая не исходит из нуля на более значительную величину, чем предполагает разность размеров кювет, то может идти речь о частичном разложении реактива, который вызывает окраску раствора с определяемым веществом. Иными словами, в результате разложения реактива образуется небольшое количество вещества, которое вступает в реакцию с определяемым веществом. Конечно, можно закрыть на это глаза, но лучше этого не делать и подвергнуть реактив очистке. Зачем это нужно? А делать это нужно для того, чтобы исключить побочные реакции, которые существенно снижают надежность последующих анализов.
Существует еще одно правило, которое следует неукоснительно соблюдать: не производить аналитические определения за пределами калибровочного графика. Это ни к чему хорошему не приводит, так как есть большой риск получения большой систематической ошибки. Но тут есть радующее душу исключение. Если калибровочная прямая исходит из нуля (если она теоретически должна из него исходить), то можно производить определения ниже нижней границы калибровки. Если же прямая должна исходить из нуля, но она из него не исходит, то риск ошибиться при определении малых концентраций вещества неизбежно многократно возрастает!
Тогда закономерно возникает вопрос: а что делать, если концентрация в анализируемой пробе находится за границами калибровочного графика? Ответ будет незатейлив: берите меньшую аликвоту для анализа пробы с высоким содержанием вещества и концентрируйте пробу для анализа с малым содержанием определяемого компонента.
Построение калибровочных графиков и их применение.
Построение калибровочных графиков и их применение.
Для построения калибровочного графика готовят серию стандартных растворов, охватывающих диапазон измеряемых концентраций исследуемого вещества согласно методике.
Калибровочный график строят по 5-6 сериям шкал; количество концентраций в каждой шкале должно быть не мене 5. Резко отличающиеся значения оптической плотности не учитывают. Из остальных рассчитывают среднее арифметическое значение для каждой концентрации и строят график зависимости оптической плотности от концентрации вещества (рисунок 14).
Примерный размер графика 20-25×30 см; прямая должна проходить через начало координат под углом приблизительно 45°. В идеальном случае все точки располагаются на прямой, обычно часть точек располагается на прямой, часть выше и ниже ее, точки как бы чередуются.
На графике должны быть указаны условия фотометрирования: номер светофильтра или длины волны (нм); размер кюветы (мм); время фотометрирования. Кроме того, должна быть указана дата построения калибровочного графика. Калибровочный график необходимо периодически проверять по 2-3 концентрациям.
Наиболее распространенными приборами являются фотоэлектроколориметр ФЭК-56М, колориметр фотоэлектрический однолучевой КФО, колориметр фотоэлектрический концентрационный КФК-2 (рисунок 15), КФК-2МП с микропроцессорной системой «Электроника» и спектрофотометр СФ-46 (таблица 2).
Спектральный диапазон, нм
Надежность результатов измерений при работе на фотоэлектроколориметрах и спектрофотометрах обеспечивается, правильной установкой и эксплуатацией приборов. Поэтому приступать к измерениям можно только после тщательного ознакомления с описанием устройства прибора и правил его эксплуатации.
Прямое фотометрическое определение железа
Большие содержания железа
Построение калибровочного графика для прямого
фотометрического определения железа
Для ряда аналитов сложилась система промышленного приготовления рабочих калибраторов, состав которых сверяется с созданными международными (или национальными) организациями эталонами. Надежное выполнение лабораторных анализов предполагает, что свойства вещества «прослежены» от международного эталона до конкретного материала, по которому калибруется метод в данной лаборатории.
Калибровка обязательна при налаживании метода. Частота ее проведения в последующем зависит от конкретных обстоятельств. Она необходима при смене реактивов, а также если внутрилабораторный контроль качества исследований свидетельствует о наличии существенных погрешностей.
Следует иметь в виду, что результат калибровки может зависеть от качества калибровочного материала. Иногда промышленные фирмы предлагают калибровочные материалы пригодные только для одного метода, чаще всего для того, который служит основой набора реагентов, который комплектуется данным калибровочным материалом. Иногда эти материалы являются лишь имитаторами калибраторов, способными только в совершенно определенных условиях развивать окраску, похожую на ту, которая развивается при выполнении анализа. Изменение условий или использование таких «калибраторов» для других методов может быть источником грубых ошибок.
Принципы калибровки. Правила построения калибровочного графика.
В простейшем случае, когда работа выполняется вручную, строится калибровочный график. Для этого на одной оси откладывают концентрацию аналита, а на другой размер непосредственно полученных значений (например, оптической плотности). Соединив точки, отражающие реально выявленную зависимость между измеренными значениями и концентрацией аналита, получают линию, по которой далее ведут расчет. Задача значительно облегчается, если заранее известно, что линия должна быть прямой. Прямая линия (линейный калибровочный график) облегчает интерполяцию, т.е. определение концентраций, которые соответствуют значениями оптической плотности между калибровочными точками. Если точки не оказываются в точности на прямой линии, калибровочную линию проводят по линейке на глаз, так, чтобы линия была по возможности равно удалена (или одинаково близка) по отношению ко всем точкам. Этим достигается усреднение погрешности измерения.
Чтобы распечатать файл, скачайте его (в формате Word).
Методика построения калибровочного графика.
Рис. Схема построения калибровочной кривой
Для удобства в работе, на основе калибровочного графика расписывается калибровочная таблица, где против каждого значения экстинкции указывается соответствующая ей концентрация исследуемого компонента.
Табл. Градуировочная таблица для нахождения концентрации анализируемого вещества
| А | С |
| 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 |
В правом верхнем углу листа с представленным на нем калибровочным графиком приводят: аименование калибровочной кривой, ссылку на метод исследования, номер светофильтра (или его конкретную физическую характеристику: максимум пропускания), длину оптического пути кюветы (в мм), дату построения калибровочной (градуировочной) кривой. При этом учитывают, что у большинства обычных фотоэлектроколориметров (ФЭКов) более благоприятная область измерений лежит в пределах 0,1-0,3 ед абсорбции (максимум до 0,7).
Для того чтобы правильно построить калибровочную кривую, необходимо знать, какие условия оказывают влияние на расположение линии в системе координат.
Если абсорбция опытной пробы оказывается не скорригированной на экстинкцию контрольной, то часто не удается достигнуть совпадения нулевого значения оптической плотности с нулевым значением концентрации. Методы с таким построением калибровочного графика не рекомендуются для использования в клинико-диагностических лабораториях.
Известен ряд причин, вызывающих нарушение прямо пропорциональной зависимости между абсорбцией и концентрацией вещества в растворах.
1) присутствие в среде посторонних электролитов, вызывающих деформацию молекул или комплексных ионов окрашенных веществ;
2) гидратация (сольватация), сказывающаяся на поглощении раствором светового потока с изменением концентрации раствора этот процесс протекает неравнозначно;
3) неполное взаимодействие исследуемого вещества с реактивом при его разбавлении;
4) изменение взаимовлияния частиц при разбавлении раствора;
5) сдвиг рН раствора, влияющий на полноту образования и состав молекул окрашенного соединения;
6) изменение степени диссоциации вещества в растворе при разбавлении.
Основное значение в нарушении прямо пропорциональной зависимости между абсорбцией и концентрацией имеет то обстоятельство, что сопровождающаяся образованием окрашенного соединения химическая реакция протекает не строго стехиометрично, т.е. реакция не всегда бывает полной. Примером этому служит взаимодействие аммиака с реактивом Несслера.
Кроме причин, связанных с состоянием вещества в растворе, ряд физических факторов, в частности недостаточная монохроматизация светового потока, способны вызвать отклонения в прямо пропорциональной зависимости между оптической плотностью и концентрацией. В случае если через абсорбируемый слой пропускается световой поток со значительным интервалом длин волн, то величина экстинкции может изменяться неравномерно с увеличением (уменьшением) толщины слоя раствора и концентрации вещества в нем, приводя тем самым к искривлению калибровочной линии.